Stopnjo fosforilacije organskih molekul ali snovi določata dve metodi: western blotting in masna spektrometrija. Fosforilacija se najpogosteje nanaša na vezavo fosfata na beljakovine. Ko se fosfati vežejo na beljakovine, so moteni naravni procesi in funkcije beljakovinskih encimov v človeškem telesu. Določanje ravni fosforilacije je ključnega pomena za zdravljenje širokega spektra bolezni, od raka do sladkorne bolezni.
Western blotting je priljubljena metoda, ki se uporablja za določanje ravni fosforilacije določenega niza beljakovin. Običajno se uporabljajo protitelesa, kot so monoklonska protitelesa proti fosfo-tirozinu, ker se zlahka vežejo na ostanke tirozina v proteinu, na katere vpliva fosforilacija. Pri Western blottingu se beljakovine najprej ločijo po velikosti z uporabo metode električnega naboja, znane kot gel elektroforeza.
Beljakovine se nato prenesejo na membrano, ki je prekrita s posebnimi protitelesi, ki se vežejo na fosfate na beljakovinah. Ko se proteini prenesejo, se protitelesa prilepijo na vse beljakovine z vezanim fosfatom. Stopnjo fosforilacije lahko nato določimo z rentgenskim žarkom membrane. Vse prizadete beljakovine bodo oddajale blisk svetlobe, kar bo raziskovalcu olajšalo merjenje ravni fosforilacije.
Masna spektrometrija je še en način za merjenje ravni fosforilacije snovi. Ta proces pretvori beljakovinske molekule v ione, zaradi česar jih je lažje slediti in meriti. Vzorec je ioniziran z močnim ionskim virom, ki preplavi vzorec z elektroni. To dejanje spremeni vzorec v katione, pozitivno nabite ione.
Masni analizator masnega spektrometra loči ione po njihovi masi in intenzivnosti naboja. To omogoča raziskovalcu, da odkrije razmerje med maso in nabojem, ki je ključnega pomena pri odkrivanju stopnje fosforilacije vzorca. Končno detektor meri ione tako, da se podatki lahko prikažejo v obliki grafikona. Tabela prikazuje razmerje med maso in nabojem ionov na osi x in relativno intenzivnost ionov na osi y.
Ravni fosforilacije lahko merimo tudi med fosforilacijo substrata. Fosforilacija substrata je proces, ki med glikolizo ustvari adenozin trifosfat (ATP), molekulo, ki je ključna za prenos energije med celicami. Ta proces se pojavlja tako v živalskih celicah kot v rastlinskih celicah.
V rastlinskih celicah se molekule ATP tvorijo z uporabo sončne energije. Ta energija spodbuja fosforilacijo v rastlinskih kloroplastih, mestu fotosinteze rastlin. Stopnja fosforilacije je povezana s količino fosfata, ki je potrebna za ustvarjanje dodatnih molekul ATP.