Protokol Western blot je natančen standard, po katerem se izvaja imunoblot test. Western blot se uporablja za odkrivanje beljakovin v vzorcu tkiva. Postopek ločuje naravne beljakovine z določanjem dolžin polipeptidov z uporabo gel elektroforeze. Sami proteini se nato prenesejo na nitrocelulozno membrano in jih testirajo s protitelesi.
Prvi del Western blot protokola se začne z zbiranjem tkiva. Ti vzorci so zbrani bodisi iz živega tkiva bodisi iz celične kulture. Tkivo se razgradi in uvedejo se različni inhibitorji, kot sta proteaza ali fosfataza, da se prepreči prebava encimov. Ta del protokola se običajno izvaja pri nizkih temperaturah, da se tkiva ohranijo.
Postopek gelske elektroforeze je naslednji korak v Western blot protokolu. V tem delu so proteini identificirani z različnimi dejavniki, kot sta molekulska masa ali električni naboj. Ta postopek se najpogosteje zaključi z uporabo poliakrilamidnih gelov z pufrom natrijevega dodecil sulfata. V bistvu postanejo proteini negativno nabiti in se premikajo proti pozitivno nabiti elektrodi znotraj gela.
Prenos beljakovin je naslednji del celotnega procesa Western blot. Na vrh gela je nameščena membrana, ki ji sledi filtrirni papir. Ko se dovaja električni tok, se beljakovine potegnejo v membrano. To se imenuje dejanski del analize. Membrane so zelo krhke in zlahka občutljive na poškodbe.
Pravilen potek protokola Western blot zahteva korak, znan kot vezava. Da bi preprečili kontaminacijo samih beljakovin s protitelesi, ki jih je treba dodati, je treba izvesti nekakšno zaščito. Najpogostejša vrsta blokiranja uporablja nemastno suho mleko in detergent. To se veže na odprta mesta v membrani in omogoča jasnejše rezultate, ko dodamo protitelo.
Odkrivanje je naslednji korak v skladu s pravilnim protokolom. Beljakovine se uvedejo v protitelesa, ki so povezana s specifičnim encimom, ki bo raziskovalcem dal želene informacije. Protitelo inkubiramo z membrano 30 minut ali več. Nato se membrana spere in uvede se sekundarno protitelo, ki se veže na prvo. Pogosto se luminiscenčno sredstvo uporablja za pomoč znanstvenikom pri procesu identifikacije.
Material se ponovno opere, da se odstranijo morebitni nevezani predmeti. Analiza velikosti obarvanih pasov razkrije informacije o izstopanju in obsegu določene beljakovine. To se običajno opravi nekajkrat, da se zagotovi pravilna analiza. Možnosti za odkrivanje vključujejo rentgenske žarke, barvanje in kemikalije.