Spektrofotometer je eden od znanstvenih instrumentov, ki ga običajno najdemo v številnih raziskovalnih in industrijskih laboratorijih. Spektrofotometri se uporabljajo za raziskave v fiziki, molekularni biologiji, kemiji in biokemijskih laboratorijih. Običajno se ime nanaša na ultravijolično vidno (UV-Vis) spektroskopijo.
Energija svetlobe je odvisna od njene valovne dolžine, običajno označene kot lambda. Čeprav se elektromagnetni spekter razprostira na ogromnem območju valovnih dolžin, lahko večina laboratorijev izmeri le majhen del le-teh. UV-Vis spektroskopija meri med 200 in 400 nanometrov (nm) za meritve UV svetlobe in do približno 750 nm v vidnem spektru.
Za UV-Vis spektroskopijo se vzorci običajno hranijo in merijo v majhnih posodah, imenovanih kivete. Ti so lahko plastični, če se uporabljajo v vidnem spektru, vendar morajo biti kremen ali taljeni silicijev dioksid, če se uporabljajo za UV meritve. Obstaja nekaj strojev, ki lahko uporabljajo steklene epruvete.
Vidna spektroskopija se pogosto industrijsko uporablja za kolorimetrijo. S to metodo merimo vzorce pri več valovnih dolžinah od 400-700 nm, njihove profile absorbance pa primerjamo s standardom. To tehniko pogosto uporabljajo proizvajalci tekstila in črnila. Drugi komercialni uporabniki UV-Vis spektroskopije vključujejo forenzične laboratorije in tiskalnike.
V bioloških in kemičnih raziskavah se raztopine pogosto kvantificirajo z merjenjem stopnje njihove absorpcije svetlobe pri določeni valovni dolžini. Za izračun koncentracije spojine se uporablja vrednost, imenovana ekstincijski koeficient. Laboratoriji za molekularno biologijo na primer uporabljajo spektrofotometre za merjenje koncentracij vzorcev DNK ali RNA. Včasih imajo napreden stroj, imenovan spektrofotometer NanoDrop™, ki uporablja delček količine vzorca v primerjavi s tistim, ki ga uporabljajo tradicionalni spektrofotometri.
Da bi bila količinska opredelitev veljavna, mora vzorec upoštevati Beer-Lambertov zakon. To zahteva, da je absorpcija neposredno sorazmerna z dolžino poti kivete in absorpcijo spojine. Obstajajo tabele koeficientov ekstinkcije za številne, vendar ne za vse spojine.
Številne kemične in encimske reakcije sčasoma spremenijo barvo, spektrofotometri pa so zelo uporabni za merjenje teh sprememb. Na primer, encimi polifenol oksidaze, ki povzročajo rjavenje sadja, oksidirajo raztopine fenolnih spojin in spremenijo bistre raztopine v tiste, ki so vidno obarvane. Takšne reakcije je mogoče oceniti z merjenjem povečanja absorbance, ko se barva spremeni. V idealnem primeru bo stopnja spremembe linearna in iz teh podatkov je mogoče izračunati stopnje. Naprednejši spektrofotometer bo imel temperaturno nadzorovano držalo za kivete za izvajanje reakcij pri natančni temperaturi, ki je idealna za encim.
Mikrobiološki in molekularni biološki laboratoriji pogosto uporabljajo spektrofotometer za merjenje rasti kultur bakterij. Poskusi kloniranja DNK se pogosto izvajajo v bakterijah in raziskovalci morajo izmeriti stopnjo rasti kulture, da vedo, kdaj izvesti določene postopke. Na spektrofotometru merijo absorbanco, ki je znana kot optična gostota (OD). Iz OD je mogoče ugotoviti, ali se bakterije aktivno delijo ali pa začenjajo umirati.
Spektrofotometri uporabljajo vir svetlobe za osvetlitev niza valovnih dolžin skozi monokromator. Ta naprava nato oddaja ozek pas svetlobe, spektrofotometer pa primerja intenzivnost svetlobe, ki prehaja skozi vzorec, s tisto, ki prehaja skozi referenčno spojino. Na primer, če je spojina raztopljena v etanolu, bi bila referenca etanol. Rezultat je prikazan kot stopnja absorbance razlike med njima. To kaže na absorbanco vzorčne spojine.
Razlog za to absorpcijo je v tem, da imata tako ultravijolična kot vidna svetloba dovolj energije, da vzbudita kemikalije na višje energetske ravni. To vzbujanje povzroči višjo valovno dolžino, ki je vidna, ko se absorbanca nariše proti valovni dolžini. Različne molekule ali anorganske spojine absorbirajo energijo pri različnih valovnih dolžinah. Človeško oko vidi tiste z največjo absorpcijo v vidnem območju.
Raztopine spojin so lahko bistre, vendar se absorbirajo v UV območju. Takšne spojine imajo običajno dvojne vezi ali aromatske obroče. Včasih obstaja en ali več zaznavnih vrhov, ko se stopnja absorpcije izriše glede na valovno dolžino. Če je tako, lahko to pomaga pri identifikaciji nekaterih spojin s primerjavo oblike grafa z obliko znanih referenčnih grafov.
Obstajata dve vrsti UV-Vis spektrofotometrskih strojev, z enim žarkom in z dvojnim žarkom. Ti se razlikujejo po tem, kako merijo intenzivnost svetlobe med referenčnim in preskusnim vzorcem. Stroji z dvojnim žarkom merijo referenčno in testno spojino hkrati, medtem ko stroji z enim žarkom merijo pred in po dodajanju testne spojine.