Kaj je kvantifikacija RNA?

Kvantifikacija ribonukleinske kisline (RNA) je sredstvo za določanje povprečne koncentracije RNA v raztopini. To določanje je mogoče izvesti z različnimi postopki, ki običajno spadajo v eno od dveh kategorij: spektrofotometrija ali kvantifikacija fluorescentnega barvila. Spektrofotometrija temelji na sposobnosti RNA, da absorbira določene valovne dolžine ultravijolične svetlobe. Nekatera fluorescentna barvila, kot je etidijev bromid, se lahko vežejo na nukleinske kisline, kot je RNA, in fluorescirajo, ko se vežejo, kar omogoča merjenje svetilnosti.

Ko je RNA izpostavljena ultravijolični svetlobi, bo to svetlobo selektivno absorbirala pri valovnih dolžinah 260 nanometrov (nm) in 280 nm. Ta metoda se izvaja v spektrofotometru, ki proizvaja valovne dolžine ultravijolične svetlobe in meri svetlobo, ki prehaja skozi RNA. Večje koncentracije RNA bodo absorbirale več svetlobe.

Kombinacija teh dveh valovnih dolžin se pogosto uporablja pri kvantifikaciji RNA, saj ta metoda omogoča raziskovalcem, da se naučijo, ali je vzorec kontaminiran z drugimi makromolekulami, kot so beljakovine. Ti onesnaževalci pogosto selektivno absorbirajo svetlobo 280 nm, ne pa tudi svetlobe pri 260 nm. Posledično lahko z izračunom razmerja absorbirane svetlobe na obeh valovnih dolžinah določimo stopnjo kontaminacije.

Kvantifikacija RNA z uporabo fluorescenčnih barvil daje rezultate, ki so manj dovzetni za nekatere onesnaževalce in se lahko uporabljajo z nizkimi ravnmi RNA, ki bi onemogočale spektrofotometrijo. Barvila, kot je etidijev bromid, se bodo vezala na RNA, nastalo svetilnost pa je mogoče izmeriti neposredno s fluorescenčnimi fotometri. Če fotometer ni na voljo, se lahko pripravijo raztopine z znanimi koncentracijami RNA in svetilnost neznanega vzorca se lahko približno primerja s temi. Razmerje med svetilnostjo in koncentracijo RNA je linearno, zato lahko raziskovalci hitro določijo meritev koncentracije iz svetilnosti.

Kvantifikacija RNA z uporabo katere koli metode je lahko zelo občutljiva na različne kontaminante. Beljakovine, fenol in veliki delci lahko povzročijo netočne rezultate spektrofotometrije. Ti onesnaževalci ne vplivajo na kvantificiranje RNA fluorescentnega barvila, vendar je ta metoda lahko netočna zaradi prisotnosti deoksiribonukleinske kisline (DNK) v vzorcu.

Barvila, ki vežejo nukleinske kisline, bodo vezala tako DNK kot RNA in pokazala podobno svetilnost, zato je pomembno zagotoviti čist vzorec RNA. Običajni način za dosego tega je z dodajanjem encima, ki uniči DNK, kot je DNAza, mešanemu vzorcu, preden dodate barvilo. Glede na koncentracijo RNA v vzorcu in prisotne kontaminante lahko laboratoriji za količinsko opredelitev RNA uporabijo katero koli od teh metod.