Konfokalni mikroskop je posebna vrsta fluorescenčnega mikroskopa, ki se uporablja za pridobivanje visokokakovostnih 2D in 3D slik. Z osnovnim (širokopoljskim) fluorescenčnim mikroskopom se na vzorec osvetli svetloba določene valovne dolžine in vzorec absorbira del te svetlobe, preostanek pa odbija pri daljši valovni dolžini. Svetloba z daljšo valovno dolžino prehaja skozi dikroično zrcalo, ki omogoča prehod svetlobe z daljšo valovno dolžino, ne pa izvirne (krajše) valovne dolžine. Oseba, ki gleda vzorec, vidi samo svetlobo, ki je prešla skozi dikroično zrcalo. Osnovni fluorescenčni mikroskopi zajamejo svetlobo v izostritvi in zunaj nje, kar dobro deluje pri velikih vzorcih, kjer ni potrebna zelo visoka ločljivost. Ne deluje tako dobro za ogled finih podrobnosti. Za zajemanje fluorescentnih slik visoke ločljivosti je potreben konfokalni mikroskop.
Konfokalni mikroskop uporablja luknjico za zavrnitev izostrene svetlobe. Namesto da svetloba prehaja samo skozi dikroično zrcalo, svetloba prehaja tako skozi dikroično zrcalo kot luknjico, kar pomeni, da oseba, ki gleda vzorec, vidi samo eno točko vzorca. Za ogled celotnega vzorca premična zrcala skenirajo svetlobo čez pravokotno ravnino vzorca, računalnik pa zbira oddano svetlobo, ko se vzorec skenira. Popolno skeniranje bo povzročilo optično rezino ali prečni prerez vzorca. Ta vrsta mikroskopije se imenuje konfokalna laserska skenirna mikroskopija, deloma zato, ker se kot vir svetlobe uporablja laser.
Za ustvarjanje 3D slike se izvede več skeniranj, pri čemer se ustvari več “rezin” vzorca, računalnik pa vsako rezino združi, da ustvari tridimenzionalno sliko. Mikroskop je mogoče programirati tako, da spreminja prostor med rezinami, odvisno od tega, kako jasno 3D sliko želi uporabnik dobiti. Mikroskop lahko spreminja tudi hitrost, s katero skenira sliko, pri čemer počasno skeniranje daje višjo ločljivost kot hitro skeniranje.
Konfokalni mikroskop je postal zelo pogosto uporabljen kos opreme v mnogih laboratorijih znanosti o življenju. So drage in nekoliko velike ter imajo pogosto prostore, namenjene njihovi uporabi, saj mora biti prostor temen, da dobimo dobro fluorescentno sliko. Čeprav se konfokalni mikroskopi najpogosteje uporabljajo za ogled celic in struktur znotraj celic, jih je mogoče uporabiti za pridobitev slike katerega koli tridimenzionalnega fluorescenčnega vzorca in se včasih uporabljajo za ogled polprevodniških materialov.