Agarozni gel je snov, ki se uporablja v biokemiji in biotehnologiji za gelsko elektroforezo in velikostno izključitveno kromatografijo, ki sta metodi razvrščanja velikih molekul glede na njihovo velikost in električni naboj. Ti procesi uporabljajo agarozo za ločevanje in analizo beljakovin in DNK. Za te aplikacije je zelo primeren zaradi svoje molekularne strukture, ki omogoča, da se molekule različnih velikosti premikajo skozi njo z različnimi hitrostmi. Material se pridobiva iz različnih vrst morskih alg in ga običajno najdemo v laboratorijih v obliki prahu. Za pripravo primernega medija za dani test prašek dodamo vodi v ustrezni koncentraciji, zavremo in pustimo, da se ohladi v gel.
Izdelava
Agaroza se pridobiva v obliki agarja iz več vrst rdečih morskih alg ali morskih alg, ki jih najdemo v Kaliforniji in vzhodni Aziji. Agar, izraz, ki izhaja iz malajske besede agar-agar, kar pomeni žele, se običajno pridobiva iz vrst morskih alg Gelidium. Sestavljen je iz dveh različnih snovi, znanih kot agaroza in agaropektin, in zagotavlja podporo celičnim stenam v morskih algah. Ko ga odstranite, se lahko agar uporablja kot gostilo za hrano, podobno kot želatina, ali kot odvajalo. Če je prečiščen, se lahko uporablja kot medij za gojenje bakterij, gliv ali drugih mikroorganizmov.
V agarju je dokaj enostavno ločiti agarozo od agaropektina, ker se molekule agaroze med seboj močno vežejo, medtem ko se agaropektin slabo gelira. Obstaja več metod za izolacijo agaroze. Pri eni metodi se agarju doda karagenan, druga molekula, ki jo najdemo v rdečih morskih algah, in sol. To povzroči, da se agaropektin obori ali tvori trdna snov, ki jo je mogoče odstraniti iz raztopine agarja. Druga metoda dodaja encim pektinazo, kemikalijo, ki razgradi agaropektin in mu omogoči, da se raztopi v vodi.
Elektroforeza z gelom
Agarozni gel je najpogosteje povezan z elektroforezo. Pri tem postopku znanstveniki nanesejo električno polje na ploščo materiala, ki vsebuje raztopljene fragmente DNK, RNA ali beljakovin. To povzroči, da se te velike molekule premikajo zaradi njihovih električnih nabojev: pozitivno nabiti se bodo premikali proti negativni strani in obratno. Fragmenti DNK in RNA imajo negativen naboj in se tako premikajo proti pozitivnemu koncu, medtem ko so proteinski fragmenti lahko negativni ali pozitivni.
Hitrost gibanja molekul je odvisna od njihove velikosti in od tega, kolikšen naboj imajo. Agarozni gel je strukturiran tako, da tvori nekakšno mrežo z luknjami, skozi katere lahko potujejo druge molekule. Manjši lažje gredo skozi luknje in tako hitreje potujejo. Pri večjih molekulah igra vlogo tudi oblika, saj lažje prehajajo bolj kompaktne molekule. Tehnika se uporablja tako za analizo vzorcev kot za izolacijo določenih sekvenc DNK za uporabo v biotehnoloških aplikacijah.
Pred elektroforezo bi vzorec DNK obdelali s posebnimi encimi, ki na določenih mestih razrežejo dolge verige podobne molekule in tako naredijo manjše fragmente. Agarozni gel pripravimo z raztapljanjem prahu v pufrski raztopini, ki je odporna na spremembe pH – kislosti/alkalnosti – ki bi sicer lahko nastale zaradi elektrokemijskih učinkov. Za različne obsege molekul se uporabljajo različne količine prahu, običajno pa je koncentracija med 0.7 in 1.2%. Na tej točki se običajno doda fluorescenčno barvilo, imenovano etidijev bromid, saj obarva DNK in jo naredi dobro vidno pod ultravijolično svetlobo. To zmes nato v mikrovalovni pečici in pustimo, da se strdi.
Vzorci DNK se vstavijo v majhne vdolbinice v gelu in preko njih se uporabi enosmerni električni tok. Molekule različnih velikosti potujejo po gelu z različnimi hitrostmi, tako da se bodo po določenem času pojavile na različnih položajih, z manjšimi fragmenti naprej proti pozitivnemu koncu. To omogoča znanstvenikom, da določijo velikosti fragmentov in izolirajo različna zaporedja DNK.
Druge uporabe
Agarozni gel se včasih uporablja v sorodni tehniki, ki ne vključuje električne energije, znani kot kromatografija z izključitvijo velikosti. Pri tej metodi se steklena kolona napolni s kroglicami iz gela in vanjo se vlije raztopina, ki vsebuje različne velike molekule. V nasprotju z elektroforezo se večje molekule hitreje premikajo navzdol po koloni, da izstopijo na dnu, medtem ko napredek manjših je v kroglicah upočasnjen. To je zato, ker se majhne molekule ponavadi absorbirajo v pore v gelu, medtem ko so večje prevelike, da bi vstopile v te pore, in namesto tega tečejo med kroglicami. Tip in koncentracijo gela je mogoče prilagoditi velikostim molekule, ki jo je treba ločiti.