Razlike med maslom in margarino so včasih opisane kot nominalne, na splošno s strani privržencev margarine, ali bistveno drugačne, kot poročajo strokovnjaki za maslo ali zdravstveni strokovnjaki. Po internetu je več člankov dvomljive pristnosti, ki celo trdijo, da je margarina le ena molekula stran od tega, da postane plastična. Najosnovnejša razlika med tema dvema snovmama pa je v tem, da je maslo pridobljeno iz živalske maščobe, margarina pa iz hidrogeniranih rastlinskih olj.
Maslo je veliko starejši prehrambeni izdelek kot margarina. Maslo se proizvaja iz maščobne smetane kravjega mleka, lahko pa se uporabijo tudi druga živalska mleka. Maščobne molekule se običajno držijo v suspenziji v smetani, vendar enakomerno mešanje v mešalniku masla povzroči, da se maščobne molekule oprimejo same sebe in sčasoma izpadejo iz smetane kot gosta masa masla. Surovemu maslu se pogosto doda sol, vendar ni nujno potrebna. Kuhano maslo je skoraj v celoti sestavljeno iz nasičenih maščob, skupaj s precejšnjo količino naravnega holesterola.
Po drugi strani pa je margarina izdelan prehrambeni izdelek, zasnovan posebej za nadomestek masla leta 1869. Zgodnji izdelki iz margarine so kot sestavino uporabljali govejo maščobo, vendar se je večina formul margarine v začetku 20. stoletja spremenila v rastlinska olja. Običajno tekoče rastlinsko olje se strdi s postopkom, ki vključuje mehurčke vodikovega plina, ki prehajajo skozi zmes. Rezultat je trden nadomestek masla brez holesterola in z malo nasičenih maščob, če sploh. Margarina pa vsebuje polinenasičene in transmaščobne kisline, za katere mnogi zdravstveni strokovnjaki menijo, da so nezdrave za ljudi zaradi njihove nagnjenosti k zamaševanju arterij.
Maslo in margarina se razlikujeta tudi po roku uporabnosti. Maslo je treba hraniti v hladilniku, da ostane sveže več dni. Margarino je treba ohladiti, da ohrani trdno obliko med uporabo, vendar lahko ostane stabilna veliko dlje kot maslo. Maslo, tako kot mnogi drugi živilski izdelki na osnovi mlečnih izdelkov, se lahko pokvari ali žarko brez ustreznega shranjevanja in hlajenja. V receptih se lahko uporabljata tako maslo kot margarino, vendar se zdi, da je maslo privzeta izbira profesionalnih kuharjev, medtem ko so margarini naklonjeni bolj priložnostni kuharji. Maslo je pogosto dražje od margarine, razlika v okusu ali teksturi med maslom in margarino pa je lahko zelo subtilna, odvisno od kakovosti uporabljenih blagovnih znamk.